呼吸醌鉴定实验

Published at 2021-03-19 10:35

Author:jiangxw

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醌提取步骤

菌体的收集制备:

菌体可用液体培养也可以固体培养,收集后-80 ºC冷冻2 h以上,真空干燥。真空冷冻干燥的菌体4 ℃保存备用或放入干燥器干燥保藏。

提取及纯化

  • 取冻干菌体约100 mg,加入氯仿:甲醇=2:1 的溶液40 mL,在黑暗处震荡2 h左右。
  • 在黑暗处用滤纸过滤收集滤液。
  • 用减压旋转蒸发仪40 ℃减压蒸馏至干燥。
  • 用少量(1 mL)丙酮重新溶解干燥物(含醌)。
  • 将 600 ul 的氯仿:甲醇=2:1 溶液加入旋蒸瓶中,溶解干燥物(含极性脂,4 ºC保存备用,也可用石油醚溶)。

醌的纯化

  • 用GF254 硅胶板上(5×10 cm),1.5 cm处用铅笔画条横线,样品全部点样于1.5 cm线处呈长条状。
  • 以甲苯作展层剂展层约 20 min。
  • 取出风干后在 254 nm 紫外灯下观察。Rf=0.8,在绿色荧光背景下呈暗褐色的带即为甲基萘醌条带。
  • 刮下 Rf=0.8 的带,用0.5 mL 丙酮溶解,然后用细菌滤器过滤除去硅胶,收集滤液,即得甲基萘醌的样品液。置于4 ℃、黑暗处保存备用。

醌的 HPLC 分析 (Agilent 1260)

高效液相色谱分析法进行甲基萘醌的测定。色谱柱为反相柱十八烷基硅烷(ZORBAX Eclipse XDB-C18,4×250 mm, 5 μm),流动相为甲醇:异丙醇=35:65(0 min)→56:44 (30 min),溶液,流速为 1 mL/min,柱温为 40 ℃,249 nm 和 270 mn紫外检测。