16S rRNA基因的克隆制备

一、DNA提取（chelex法提取）

详情见16s rRNA 序列提取

二、PCR扩增

每个DNA样品要做两个平行来扩PCR,扩增量为100 μL。进行电泳（点样时用大梳子）。电泳条件为：180 V，200 A，30-35 min，凝胶成像检测条带。

三、割胶（UV illuminator GL-312仪器）

铺一个一次性手套于UV illuminator上，将胶置于手套上，打开UV（head按钮），上面观察，用解剖刀将亮的条带处割下后，切成小块放于1.5 mlEP管中（空管先称重）。

注：胶不要放紫外下太久，切小块时关掉紫外灯，一般胶约0.2-0.3 g重，不要切混DNA条带。

四、柱纯化（普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 离心柱型）

• 柱平衡步骤：吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入500 ul平衡液BL，12000 rpm（13400×g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）

• 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。

• 向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1 g,其体积可视为100 ul，则加入100 ul PN溶液），50 ℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解（若胶块体积过大，可事先将胶块切成碎块）。 注意：对于回收<300 bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。

• 将上一步所得溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12000 rpm离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 注意：吸附柱容积为800 ul，若样品体积大于800 ul可分批加入。

• 向吸附柱中加入600 ul漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2-5 min再离心。

• 重复操作步骤5。

• 将吸附柱放回收集管中，12000 rpm离心2 min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱置于室温放置5-10 min，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

注：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

• 将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB（最好先预热60-70℃），室温放置2 min。12000 rpm离心2 min收集DNA溶液。 注意：洗脱体积不应小于30 ul，体积过少影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20 ℃，以防DNA降解。DNA也可用缓冲液（10 mM Tris-Cl, pH8.0）洗脱。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12000 rpm离心2 min，将DNA溶液收集到离心管中。

五、连接（在冰盒中进行）pEASY-T1 cloning Kit

载体：pEASY-T1 准备一个冰盒和一支无菌扩PCR的小管，按下列体系加入：

将加过上述体系的样品置于PCR仪中，25 ℃，处理20 min。

六、转化

在冰盒中进行，且该步骤的准备工作应在连接剩余约5min时准备，使之正好衔接

• 取出pEASY-T1（competeny cell）感受态细胞于冰盒中解冻（-80 ℃冰箱中层，每管是100 ul，仅能做两株菌），解冻后取出50 ul于另一支无菌1.5 ml空EP管中，分成两份。 （注：该步操作必须在连接完成前准备，正好连接结束时准备完毕,特别注意感受态取出时间，会影响目的基因导入感受态的成功率)

• 在每支装有50ul感受态细胞的EP管中加入5 ul连接液，轻弹混匀，冰浴20-25 min。

• 热激。将样品放入42 ℃水浴中热激60 s，立即冰上静置10 min，注意拿时不要晃动。

• 加入200 ul LB培养液（该培养液不含抗生素，且加入量要保证整个样品管中液体总量>200 ul，因为要涂布两个板，每个板样品涂布量为100 ul），37 ℃，170 rpm摇床处理1.5 h。（该过程目的是使质粒进入细胞，也可延长至2 h）

• 涂布。取100 ul上述菌液涂布于LB/Kan平板上（加有卡那霉素50 mg/ml，添加量为100 ul/100 ml LB培养基），做两个平行板。涂布后的平板于37 ℃培养箱培养6-12 h，平板先正放1h保证菌液被平板吸收，再倒置。

注：配制加有抗生素平板时，加入抗生素后最好不要超过24 h（从加抗生素→倒平板→培养结束），倒平板时，等培养基冷却至不烫手时再加抗生素。

• 准备LB/Kan的固体平板，或是灭过菌的LB液体培养基和带塞空试管（也可用EP管，加1 ml培养液）无菌操作将AMP（氨苄青霉素，添加量为100 ul/100 ml）加入LB液体培养基中，并分装于试管中（3-4 ml/管），并做两个CK管。用培养皿装枪头灭菌烘干备用。

• 等步骤5中的平板培养结束后（长出的即为单克隆，有重组子或空载），第一个方法直接划线在加有LB/AMP的固体培养基中；第二个方法用竹签挑取长出的单菌落于装有LB/AMP液体培养基试管中。将接过单克隆的试管于37 ℃摇床震荡培养8-10 h（培养液浑浊即可）。

• 扩PCR进行克隆检测 第一个方法：直接按照16s rRNA 序列提取方法提取DNA。 第二个方法： 按下列体系加入（PCR反应体系是26 ul，较小，仅用于检测是否克隆成功）

以上溶液混匀，分装于两份（每份26 ul）

PCR程序：16s rRNA 序列提取中PCR设置

电泳：Marker：Trans 4K；电流：100-200 A；时间：35-40 min

• 送样测序 16s rRNA DNA样品送样测序，或取PCR对应的阳性克隆试管培养液1 ml于1.5 mlEP管中，送样测序。试管中其他液体于4 ℃保存。

注：实验步骤因试剂产品而有所差异