16S rRNA基因的PCR扩增
Published on 2021-03-17 11:20
Author: jiangxw
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一、DNA的提取（Chelex法提取）
- 每个小EP管加30-100 μL的Chelex液，然后挑取少量菌体充分混匀，最后放入PCR仪中，条件调至85 ℃ 15 min（或是99 ℃ 20 min）（根据平时DNA的提取情况而定，没有硬性要求）.
- 12000 rpm 离心10 min。
二、扩增。
每个DNA样品要做两个平行来扩PCR。
1. PCR体系（共25 μL）
| Reagent | Dosage |
|---|---|
| H 2O | 18.85 μL |
| Buffer | 2.5 μL |
| dNTP | 2.5 μL |
| 27F | 0.5 μL |
| 1492R | 0.5 μL |
| Eazy Taq酶 | 0.15 μL |
扩增量为0.5 μL的DNA样+24.5 μL的体系（也可适当微调比例）。
2. 最后放入PCR仪中。PCR参数一般设置为
| Temp | Stage | Time |
|---|---|---|
| 94℃ | 预处理 | 10 min |
| 94℃ | 变性 | 30 s |
| 55℃ | 退火 | 30 s |
| 72℃ | 延伸 | 90 s |
| 72℃ | 10 min | |
| 16℃ | 保温 | ~ |
三、电泳
1. 制胶
100 ml TAE + 0.8 g琼脂糖，一并放入瓶中于微波炉中加热1-2 min，溶液澄清为好，取出待冷却不烫手时，加入核酸染料（标准添加量10 μL/100 ml）,混匀最后倒入电泳槽。（特别小心核酸染料有致癌性）
2. 50倍TAE的配制
Tris：242 g EDTA：18.612 g， 加800 ml去离子水，再加57.1 ml的冰乙酸，PH调至8.3，定溶至1 L。（特别注意TAE的浓度使用，电泳液和制胶用1倍的TAE）. 进行电泳点样时小梳子，5 μLDNA样品+1.5 μL的loading baffer混匀用10 μL的枪头移至胶槽孔内，Marker:5 ul。 电泳条件为：180 V,200 A，30-35 min(可适当调节电流电压，但不宜过低或过高）。
四、检测
凝胶成像检测条带，有荧光条带说明DNA提取成功，无荧光条带说明实验失败。
特别注意，试剂产品不一样，各实验条件存在差异