16S rRNA基因的PCR扩增

Published at 2021-03-17 11:20

Author：jiangxw

View：744

一、DNA的提取（Chelex法提取）

  • 每个小EP管加30-100 μL的Chelex液，然后挑取少量菌体充分混匀，最后放入PCR仪中，条件调至85 ℃ 15 min（或是99 ℃ 20 min）（根据平时DNA的提取情况而定，没有硬性要求）.
  • 12000 rpm 离心10 min。

二、扩增。

每个DNA样品要做两个平行来扩PCR。

1. PCR体系（共25 μL）

Reagent Dosage
H 2O 18.85 μL
Buffer 2.5 μL
dNTP 2.5 μL
27F 0.5 μL
1492R 0.5 μL
Eazy Taq酶 0.15 μL

扩增量为0.5 μL的DNA样24.5 μL的体系（也可适当微调比例）。

2. 最后放入PCR仪中。PCR参数一般设置为

Temp Stage Time
94℃ 预处理 10 min
94℃ 变性 30 s
55℃ 退火 30 s
72℃ 延伸 90 s
72℃ 10 min
16℃ 保温 ~

三、电泳

1. 制胶

100 ml TAE 0.8 g琼脂糖，一并放入瓶中于微波炉中加热1-2 min，溶液澄清为好，取出待冷却不烫手时，加入核酸染料（标准添加量10 μL/100 ml）,混匀最后倒入电泳槽。（特别小心核酸染料有致癌性）

2. 50倍TAE的配制

Tris：242 g EDTA：18.612 g， 加800 ml去离子水，再加57.1 ml的冰乙酸，PH调至8.3，定溶至1 L。（特别注意TAE的浓度使用，电泳液和制胶用1倍的TAE）. 进行电泳点样时小梳子，5 μLDNA样品1.5 μL的loading baffer混匀用10 μL的枪头移至胶槽孔内，Marker:5 ul。 电泳条件为：180 V,200 A，30-35 min(可适当调节电流电压，但不宜过低或过高）。

四、检测

凝胶成像检测条带，有荧光条带说明DNA提取成功，无荧光条带说明实验失败。

特别注意，试剂产品不一样，各实验条件存在差异