极性脂的鉴定方法

一、极性脂提取步骤：

1. 菌体的收集制备 菌体可用液体培养也可以固体培养，收集后-80 ºC冷冻2h以上，真空干燥。真空冷冻干燥的菌体4 ℃保存备用或放入干燥器干燥保藏。
2. 极性脂的提取及纯化 1）取冻干菌体约100 mg，加入氯仿:甲醇=2:1 的溶液40 mL，在黑暗处磁力搅拌或摇瓶2 h。 2）在黑暗处用滤纸过滤收集滤液。 3）用减压旋转蒸发仪40 ℃减压蒸馏至干燥。 4）用少量（1 mL）丙酮重新溶解干燥物（含醌）。 5）将600ul的氯仿:甲醇=2:1溶液加入旋蒸瓶中，溶解干燥物（含极性脂）。 6）含极性脂的提取液风干后，再用500ul石油醚重新溶解点样。 7）样品-18°C保存。

二、双相点样展层

（1）使用MERCK公司Silica gel 60板10×10cm； （2）距离底边1.5×1.5 cm点样(5-15μL)，点样方法下图所示； （3）展层液： 第一相：氯仿: 甲醇: 蒸馏水=65:25:4(V/V) 第二相：氯仿: 冰醋酸: 甲醇: 蒸馏水=80:18:12:5（V/V） 展层：展层顺序由第一相到第二相，第一相展层至顶边1cm取板，完全风干后再进行第二相展层（完全风干，否则会影响第二相展层。风干方法1. 约60°C烘2h; 通风橱风机打开过夜；上两种方法任选一个，此后均需吹风机均匀吹每块板不少于2min）。第二相展层后，距顶边1cm取板，自然风干后喷雾显色，点样及展层方法见图1。

三、显色

1. 显色剂的配制 (1) molybdatophosphoric acid: 5 g 磷钼酸盐溶于100 ml 95 % 乙醇. (2) ninhydrin: 0.4 g 茚三酮溶于100 ml丙酮. (3) molybdenum blue (Sigma). (4) α-naphthol: α-萘酚 : H2SO4 : 95%乙醇=0.3g: 1.3ml : 10ml

2. 显色 (1). 第一块板用磷钼酸盐显色——鉴定所有极性脂：距板10～15 cm 处用喷瓶气雾状喷显色剂，后于150 ºC烘约10 min。黄色背景上显蓝色至黑色的点。（注：磷钼酸盐显色剂可以多喷，烘烤后如果显色不理想，可以重新再喷再烘。但要注意不要烘烤过程中要注意观察板，以防烘烤过度变为黑色） (2). 第二块板先用①茚三酮显色——鉴定含有氨基的极性脂：喷显色剂后，于100℃加热6-10min。带游离氨基的磷脂如PE、PME 会出现红色至紫色, 但PC 不与茚三酮有反应。 <第二块板后用②钼蓝显色——鉴定含有磷酸基团的极性脂：不需要加热，蓝色斑点会很快显出。注意：钼蓝显色剂喷少许即可。 (3). 第一块板用α-萘酚显色——鉴定糖脂。110℃加热10min，NPG (GL)、PIDM 呈褐色。 附：常见的原核生物极性脂成分 DPG: diphosphatidylglycerol PG: phosphatidylglycerol PE: phosphatidylethanolamine PME: phosphatidylmonomethylethanolamine PC：phosphatidylcholine PI: phosphatidylinositol PIM: phosphatidylinositol mannoside L: unknown lipid; PL: unidentified phospholipid GL: unidentified glycolipid APL: unknown aminophospholipid AL: unknown aminolipid AGL: Aminoglycolipid APGL: unidentified aminophosphoglycolipid