Unicycler 简介

Unicycler 是一款专门为细菌基因组设计的混合组装工具。它支持三种输入模式：

• 仅 Illumina 短读长序列：作为 SPAdes 的优化器运行
• 仅（PacBio/Nanopore）三代长读长序列：运行 miniasm + Racon 流程
• Illumina + 三代长读（最佳模式）：进行混合组装，获得高质量、完整的细菌基因组序列

其组装的核心策略是：先用 SPAdes 基于 Illumina 数据构建高精度的组装图，再利用三代长读长跨越重复区域，解决短读序列组装中难以处理的重复序列问题，最终生成闭环的基因组序列。对于细菌基因组的完整图（complete genome）构建，Unicycler 是目前最易用、最稳定的工具之一。

Unicycler 支持 Linux 和 macOS 系统，依赖 Python 3.6+ 以及 SPAdes、Racon、Pilon、Bowtie2、Samtools、Minimap2 等外部工具。推荐通过 Conda 进行一键安装，可自动解决所有依赖关系。

为什么选择 Unicycler？

• 无需额外工具（如 Circlator）即可实现复制子环化。
• 能够处理含多个质粒的基因组。
• 混合组装中可接受任意深度和质量的 long reads（10× 以上可能足以完成基因组）。
• 生成组装图（GFA 格式），可用 Bandage 可视化。
• 极低的 misassembly 率。
• 可应对高重复基因组（如 Shigella）。
• 使用简单：单条命令即可运行，通常无需调整参数。

系统要求

• Linux 或 macOS
• Python 3.4 或更高版本
• 支持 C++14 的 C++ 编译器（GCC 4.9.1+ 或 Clang 3.5+）
• SPAdes (spades.py) 短读或混合组装必需
• Racon (racon) 长读或混合组装必需
• Pilon (pilon*.jar) 最终抛光推荐（可用 --no_pilon 关闭）
• Java 使用 Pilon 时必需
• Bowtie2 短读比对使用 Pilon 时必需
• Samtools SAM/BAM 处理 使用 Pilon 时必需
• BLAST+ (makeblastdb, tblastn) 环状序列旋转 默认启用（可用 --no_rotate 关闭）
• 可选工具： Bandage（可视化组装图，强烈推荐）

Unicycler 默认这些工具已在 $PATH 中。如果不在，可使用相应选项指定路径（如 --spades_path、--samtools_path 等）。

Unicycler 的安装

方法一：从源码安装（推荐，获取最新版本）

git clone https://github.com/rrwick/Unicycler.git
cd Unicycler
python3 setup.py install

说明：

• 如遇权限问题，可加 sudo 或以 --user 参数安装：python3 setup.py install --user
• 如需特定版本，请从 Releases 页面（https://github.com/rrwick/Unicycler/releases）下载源码
• 指定安装位置：python3 setup.py install --prefix=$HOME/.local

方法二：使用 Conda 安装（最简单）

# 创建并激活环境
conda create -n unicycler -c conda-forge -c bioconda unicycler
conda activate unicycler

# 验证安装
unicycler --help

Unicycler 的用法

Step 0：数据准备与质控

Unicycler 需要同时输入二代（Illumina）和三代（Nanopore/PacBio）测序数据。

• Illumina数据： 双端测序文件，通常为 _R1.fastq.gz 和 _R2.fastq.gz
• Nanopore或PacBio数据： 长读长文件，通常为 *.fastq.gz

质控建议（非必需，但推荐）： # Illumina 数据质控（使用 fastp） fastp -i raw_R1.fq.gz -I raw_R2.fq.gz -o clean_R1.fq.gz -O clean_R2.fq.gz --detect_adapter_for_pe

# Nanopore 数据质控（使用 Filtlong，保留 95% 高质量数据）
filtlong --min_length 1000 --keep_percent 95 raw_ont.fastq.gz > ont_clean.fastq

重要提示：

• 如测序公司已提供质控后数据（文件名含 clean、pass 等），可直接跳过此步。
• 文件路径避免使用中文字符，否则 SPAdes 可能无法正常读取。

Step 1：运行 Unicycler 混合组装

unicycler \
  -1 reads_data/R1.fq.gz \
  -2 reads_data/R2.fq.gz \
  -l reads_data/ont.fq.gz \
  -o hybrid_assembly \
  --mode normal \
  --threads 16

参数说明：

• -1 / -2 Illumina 双端测序的 R1 和 R2 文件
• -l Nanopore/PacBio 长读长文件（FASTQ 或 FASTA）
• -o 输出目录（会自动创建）
• --mode 组装模式：conservative、normal（默认）、bold
• --threads 使用的 CPU 线程数（默认 8）

其他常用参数：

• --no_correct 跳过 SPAdes 短读纠错（降低内存消耗）
• --min_fasta_length 输出序列的最小长度（默认 100，可过滤过短 contig）
• --keep 文件保留级别（0=仅最终文件，1=保留关键中间图，2=保留 SAM 文件加速重跑，3=保留所有调试文件）
• --linear_seqs 预期线性（非环状）序列的数量（默认 0，即所有序列预期为环状）
• --vcf 生成 VCF 文件（将短读比对到最终组装）

Step 2：组装过程监控

Unicycler 运行时会输出详细的日志信息，主要包括以下几个阶段：

• SPAdes read error correction：对 Illumina 短读进行纠错（最耗时）
• SPAdes assemblies：使用多个 k-mer 进行短读组装，自动选择最优结果
• miniasm assembly：将短读 contig 与长读进行混合组装
• Racon polishing：使用长读对混合组装结果进行抛光
• Pilon polishing：使用 Illumina 短读进行最终碱基校正

整个组装过程通常需要 4~8 小时（取决于数据量和服务器性能）。

Step 3：结果解读

组装完成后，输出目录下会产生以下关键文件：

• assembly.fasta 最终基因组序列（最重要！）
• assembly.gfa 组装图文件（可用 Bandage 可视化）
• unicycler.log 完整运行日志

质量评估： 查看日志末尾的组装统计信息：

grep -A 10 "Bridged assembly graph" hybrid_assembly/unicycler.log

输出示例：

Component   Segments   Links   Length      N50         Longest segment   Status  
        total          5       5   3,856,506   3,070,429         3,070,429           
            1          1       1   3,070,429   3,070,429         3,070,429   complete
            2          1       1     302,227     302,227           302,227   complete
            3          1       1     233,337     233,337           233,337   complete
            4          1       1     195,322     195,322           195,322   complete
            5          1       1      55,191      55,191            55,191   complete

解读：

• Status: complete：该序列为环状闭环（起点和终点相连）
• Segments: 1：该复制子由单条 contig 组成，无碎片
• 总长度：符合预期基因组大小（细菌通常 3~6 Mb）
• N50：越大越好，表示组装连续性好

在上例中，5 条序列全部闭环，最大的一条（3.07 Mb）为染色体，其余 4 条（302K、233K、195K、55K）根据深度推测可能为质粒。

运行模式详解：Conservative、Normal 和 Bold

Unicycler 提供三种运行模式，可通过 --mode 参数指定：

• Conservative： 最不易产生完整组装，但 misassembly 风险极低
• Normal： 平衡选项，适合大多数情况
• Bold： 最易产生完整基因组，但 misassembly 风险相对较高

如研究中组装的结构准确性至关重要，建议使用 conservative；如果你希望获得完整的基因组，即使可能包含一两个错误，则使用 bold。

完整参数列表

以下为 Unicycler 所有高级选项，可通过 unicycler --help_all 查看完整说明。

SPAdes 组装相关

• --spades_path SPAdes 可执行文件路径
• --no_correct 跳过 SPAdes 纠错步骤
• --min_kmer_frac 最低 k-mer 大小（占读长比例）
• --max_kmer_frac 最高 k-mer 大小（占读长比例）
• --kmers 精确指定 k-mer 列表（逗号分隔，如 22,33,44）
• --kmer_count k-mer 步数
• --depth_filter 过滤低于染色体深度此分数的 contig
• --largest_component 仅保留组装图的最大连通分量
• --spades_tmp_dir 指定 SPAdes 临时目录

miniasm+Racon 组装相关

• --no_miniasm 跳过 miniasm+Racon 桥接
• --racon_path Racon 可执行文件路径
• --existing_long_read_assembly 使用外部预组装 GFA 文件，跳过 miniasm/Racon

环状序列旋转相关

• --no_rotate 不旋转环状复制子
• --start_genes 起始基因 FASTA 文件
• --start_gene_id 起始基因 BLAST 最低一致性（%）
• --start_gene_cov 起始基因 BLAST 最低覆盖度（%）
• --makeblastdb_path makeblastdb 可执行文件路径
• --tblastn_path tblastn 可执行文件路径

Pilon 抛光相关

• --no_pilon 不使用 Pilon 抛光
• --bowtie2_path bowtie2 可执行文件路径
• --bowtie2_build_path bowtie2-build 可执行文件路径
• --samtools_path samtools samtools 可执行文件路径
• --pilon_path Pilon 可执行文件或 JAR 文件路径
• --java_path j Java 可执行文件路径
• --min_polish_size 短于此长度的 contig 不进行 Pilon 抛光（bp）

VCF 输出相关6.5 VCF 输出相关

• --bcftools_path bcftools 可执行文件路径

图清理相关

• --min_component_size 小于此大小的图组件将被移除（bp）
• --min_dead_end_size 小于此大小的死端将被移除（bp）

长读比对相关

• --contamination 已知污染序列 FASTA 文件
• --scores 比对得分：匹配、错配、gap 开启、gap 延伸
• --low_score 低质量比对阈值，低于此值的比对被视为不可靠

补充说明

• Unicycler 默认会使用所有可用的依赖工具，若缺少某工具，相应步骤会被跳过或报错。
• 运行时间受长读数量、基因组复杂度和线程数影响，从数小时到十余小时不等。
• 若需定制起始基因用于旋转，可使用 --start_genes 提供自定义基因 FASTA 文件。
• 若已知长读中有污染，使用 --contamination 可有效过滤。

图片摘自：Unicycler